Dinâmica das integrações de minicírculos de kDNA de Trypanosoma Cruzi no genoma hospedeiro

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016.

Análise da variabilidade gênica de antígenos de T. cruzi com aplicação para o diagnóstico sorológico da doença de Chagas

A doença de Chagas é uma zoonose causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. Estima-se que 8 milhões de pessoas estão infectadas com o T. cruzi em todo o mundo, principalmente na América Latina. Testes tradicionais de diagnóstico estão sendo gradualmente substituídos por métodos inovadores. A utilização de antígenos recombinantes foi proposta nos anos 90, e várias combinações foram testadas com soros de pacientes com diferentes formas clínicas de diferentes regiões da América Latina. Apesar do ganho em especificidade, estes testes apresentaram menor sensibilidade, frustrando expectativas. Este estudo objetivou analisar a variabilidade genética dos genes KMP11 e 1F8 que codificam antígenos comumente utilizados em diagnóstico experimental. Cepas de T. cruzi pertencentes a diferentes sub-grupos taxonômicos e de diferentes regiões foram analisadas para avaliar o impacto da variação antigênica em testes de diagnóstico. Maximizando a sensibilidade, evitar reatividade cruzada com epítopos de outros agentes patogênicos deve permitir a concepção de melhores testes rápidos. Num primeiro passo, DNA genômico foi extraído das seguintes cepas: Dm28c, Colombiana, Y, 3663, 4167, LL014 e CL Brener e foi realizada a amplificação dos genes 1F8 e KMP11 que codificam antígenos a partir destas cepas. Em seguida foram realizadas a clonagem, sequenciamento, expressão e detecção dos antígenos recombinantes. Na etapa final, análises de estruturas secundárias e terciárias, a última apenas para o antígeno 1F8, visualizaram as diferenças nas sequências de aminoácidos obtidas a partir de sequenciamento de DNA. Os resultados apresentados neste estudo mostram que o antígeno KMP11 de T. cruzi possui uma similaridade na sequência de aminoácidos muito elevada com o T. rangeli, mostrando a necessidade de um mapeamento antigênico desta proteína em todos os tripanosomatídeos que apresentaram alta similaridade com o antígeno de T. cruzi, como o T. rangeli, para verificar a presença de epítopos específicos de T. cruzi. O antígeno 1F8 pode ser uma ferramenta útil no diagnóstico da doença de Chagas e que será necessário aprofundar os conhecimentos sobre os determinantes antigênicos para futuramente elaborar poli-epítopos sintéticos adaptados de um maior número possível de antígenos, obtendo a maior especificidade e sensibilidade nos testes de diagnóstico sorológico e de teste rápido da doença de Chagas. Este estudo representa um passo crucial para a otimização de antígenos recombinantes para o diagnóstico da doença de Chagas.

Avaliação visceral da técnica sorológica para Leishmaniose visceral e doença de Chagas em animais silvestres e identificação molecular

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Avaliação visceral da técnica sorológica para Leishmaniose visceral e doença de Chagas em animais silvestres e identificação molecular

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Doença de chagas e biologia de triatomíneos (Heteroptera, Triatominae), com ênfase aos aspectos da espermatogênese

Pós-graduação em Genética - IBILCE

A influência do metabolismo redox na transmissão da doença de Chagas

As formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi proliferam e se diferenciam no interior de diferentes compartimentos do trato digestivo dos triatomíneos. Esses ambientes antagônicos, no que diz respeito à concentração de nutrientes, pH e status redox, constituem um desafio para o protozoário por conterem moléculas e fatores capazes de deflagrar diferentes sinalizações e respostas no parasito. Por isso, testamos a influência de produtos abundantes do metabolismo do vetor e de status redox distintos, frente aos processos de proliferação e diferenciação in vivo e in vitro. Como exemplo temos o heme e a hemozoína, subprodutos da digestão da hemoglobina, e o urato, rico na urina dos insetos. O heme é uma importante molécula em todos os seres vivos. Nosso grupo mostrou seu papel na proliferação in vitro de T. cruzi e que esse sinal é governado pela enzima redox-sensível CaMKII (Lara et al., 2007; Souza et al., 2009). Esse efeito parece depender de uma sinalização redox, onde o heme e não seus análigos induz a formação de EROs, modulando a atividade da CaMKII (Nogueira et al, 2011). Apesar de gerar espécies reativas de oxigênio (EROs) em formas epimastigotas, o heme não alterou a ultraestrutura desses parasitos mostrando uma adaptação a ambientes oxidantes. Além disso, a adição de FCCP inibiu a formação de EROs mitocondrial, diminuindo a proliferação dos parasitos. Em contrapartida, a AA aumentou drasticamente a produção de EROs mitocondrial levando à morte dos epimastigotas. Estes resultados confirmam a hipótese de regulação redox do crescimento de epimastigotas. A formação de β- hematina (hemozoína) constitui uma elegante estratégia para minimizar o efeito tóxico do heme nos insetos hematófagos. Contudo, a β-hematina não influenciou a proliferação ou a metaciclogênese in vitro. Já o urato, e outros antioxidantes clássicos como o GSH e o NAC prejudicaram a proliferação in vitro de epimastigotas. Estes efeitos foram parcialmente revertidos quando os antioxidantes foram incubados juntamente com o heme. Durante a metaciclogênese in vitro, o NAC e o urato induziram um aumento significativo das formas tripomastigotas e levaram a diminuição da porcentagem de formas epimastigotas. Em contrapartida, o heme e a β-hematina apresentaram o efeito oposto, diminuindo a porcentagem de formas tripomastigotas e aumentando a de epimastigotas. No intuito de confirmar a influencia do status redox na biologia do parasito in vivo, nós quantificamos a carga parasitária nas porções anterior e posterior e no reto do triatomíneo alimentado na presença ou na ausência de NAC e urato por qPCR. O tratamento com os antioxidantes aumentou a carga parasitária em todas as partes do intestino analisadas. Posteriormente, para diferenciar as formas evolutivas responsáveis pelo incremento da carga parasitária, foram realizadas contagens diferenciais nas mesmas porções do intestino do inseto vetor. Cinco dias após a infecção foi observado aumento significativo de formas tripomastigotas e diminuição de formas epimastigotas in vivo. Em conjunto, estes dados sugerem que, assim como a concentração de nutrientes e o pH, o status redox também pode influenciar a biologia do T. cruzi no interior do inseto vetor. Neste cenário, moléculas oxidantes agiriam a favor da proliferação, e em contraste, antioxidantes parecem favorecer a metaciclogênese.

Genética molecular aplicada à qualidade da carne bovina.

A manutenção da competitividade da bovinocultura de corte nacional nos mercados interno e externo implica a produção de carne com máxima eficiência e com um padrão de qualidade que atenda aos mercados mais exigentes. Dentre os fatores que determinam a qualidade da carne estão os atributos organolépticos e, dentre esses, a maciez é o principal quesito de avaliação ou apreciação por parte do consumidor. Sabe-se que há inúmeros fatores que afetam a maciez da carne bovina, como a raça do animal e os manejos pré e pós-abate. No entanto, mesmo existindo diferentes padrões de maciez entre as raças, a variação mais importante é aquela que ocorre em uma mesma raça. Por isso, a identificação precoce de animais que apresentam potencial para produção de carne mais macia, por meio da utilização de testes de DNA, constitui uma ferramenta importante para viabilizar a seleção dos reprodutores que possuam essas características, aumentando, assim, a qualidade da carne do rebanho comercial. Os ganhos genéticos poderão ser acelerados com a integração das descobertas sobre as bases genéticas e moleculares que regulam tais características aos programas de melhoramento clássico, permitindo a formação de rebanhos mais uniformes quanto às características dos produtos derivados. Para que o Brasil não só mantenha, mas também aumente sua competitividade no mercado mundial da carne, é extremamente importante que essas novas tecnologias sejam incorporadas aos programas de melhoramento genético animal, a fim de gerar informações e conhecimentos que irão garantir novos avanços qualitativos e quantitativos em médio e longo prazos nos rebanhos zebuínos e cruzados. Um dos esforços da Embrapa Gado de Corte na busca da produção de conhecimentos científicos e tecnológicos necessários para a difusão e adoção desta nova tecnologia se concretizou com a criação, em 2007, da área de Biologia Molecular aplicada ao Melhoramento Animal, visando ao desenvolvimento de novos produtos e/ou processos que sejam capazes de agregar qualidade e valor econômico ao produto final.

Biotecnología, genética molecular y cambio en la educación : necesidades educativas del profesorado de Biología y de nuevas propuestas curriculares en la Enseñanza Media y universitaria.

Los objetivos generales de esta investigación son 4: 1.- Estudio y análisis de las implicaciones educativas que conlleva la introducción y el progreso en el mundo industrial y científico, de la Biotecnología en nuestro país. 2.- Investigación del estado actual de la respuesta educativa, a nivel curricular y didáctico, al desarrollo de la Biotecnología. 3.- Investigación de las necesidades educativas del profesorado de Biología de las Enseñanzas Medias relativas a las áreas de conocimiento, básicas y aplicadas, de la Biotecnología. 4.- Propuesta de bases para desarrollar una política educativa interesada en desarrollar los currículums actuales, tanto los de Enseñanza Secundaria como los universitarios, en aspectos relativos a la Biotecnología. Para obtener la información deseada se observaron las siguientes pautas: A) se enviaron cuestionarios a todas las universidades y centros públicos de investigación. B) se enviaron cuestionarios a un número significativo de centros de bachillerato, tanto públicos como privados de cinco comunidades autónomas: Baleares, Andalucia, Madrid, Cataluña y Valencia. C) se solicitó información al Ministerio de Industria y al de Educación y Ciencia. Con el fin de recabar información necesaria para cumplimentar los objetivos señalados la investigación siguió los siguientes pasos: A) se examinó la relevancia relativa de los contenidos científicos subyacentes a la Biotecnología, así como sus aplicaciones, en la Enseñanza Media y Universitaria. B) se investigó el nivel de conocimientos y actitudes del profesorado de enseñanzas medias en relación a la Biotecnología. C) se analizó la disponibilidad de recursos didácticos y la previsión de información relativos a la Biotecnología, así como su frecuencia de uso. D) se estudió el estado del desarrollo actual de la Biotecnología en nuestro país tanto a nivel científico como, en menor medida, a nivel industrial. E) finalmente, se analizaron los esfuerzos que otros países, especialmente el Reino Unido, vienen desarrollando en el campo de la educación biotecnológica. Encuestas. Entrevistas. Estudio y análisis de documentos. En los estudios y análisis sobre muestreos todos los datos han sido tratados informáticamente. Los autores señalan una serie de recomendaciones a tener en cuenta para desarrollar una política educativa.

Construcción de modelos en biología de COU : genética molecular.

Se presentan diversas formas de construir modelos de estructuras y procesos biológicos económicos, con materiales simples, para el apoyo audiovisual en las clases de biología., como la estructura del ADN, la replicación del ADN, la síntesis del m-ARN, la replicación del cromosoma bacteriano, la estructura del ARN-t y del nucleosoma, entre otros.

Biotecnología, genética molecular y cambio en la Educación : investigación de las necesidades educativas del profesorado de Biología y de nuevas propuestas curriculares en la Enseñanza Media y Universitaria.

Establecer las implicaciones educativas y políticas que conlleva la introducción de la Biotecnología, así como la respuesta Institucional dada hasta el momento comparándola con la situación en otros países. Investigar las necesidades de alumnos y profesores en estas materias. Desarrollar unas bases para una política educativa adecuada a este tema. Profesores y alumnos de EEMM y Universidad. A) Revisión teórica y estado actual. Revisa los siguientes aspectos: definiciones, áreas de aplicación e investigación, empresas e Instituciones vinculadas y situación en otros países. B) Necesidades y actitudes de alumnos y profesores. Aplicación de encuestas por correo. Obtienen información sobre los siguientes aspectos: aspectos didácticos y curriculares de la Biológica, recursos, necesidades de formación, actitudes y líneas de investigación. Estadísticas y documentos oficiales. 2 cuestionarios elaborados ad hoc (no incluídos en la memoria). A) Análisis teórico. B) Datos directos. C) Frecuencias. En primer lugar, se constata la dificultad de una definición única de Biotecnología, aunque los campos de aplicación son más claros. Por otro lado, un 6 de los investigadores nacionales se dedican a estos temas. Además el sector privado tiene cierta presencia. También se comentan los objetivos del programa movilizador sobre Biotecnología. Respecto a los currícula, subsisten problemas de definiciones de objetivos, aunque se aportan recomendaciones. En relación con los estudios de opinión efectuados, se observan tendencias homogéneas en relación con las horas dedicadas a materias básicas, contenidos, etc. Sin embargo, los contenidos aplicados y los más novedosos están poco representados. Por otro lado, un 60 por ciento de los profesores demandan formación en éstos, que son considerados como una revolución científico-técnica que debe incorporarse al currículum. A nivel mundial, la preocupación por la Enseñanza de la Biotecnología crece. Se han creado numerosos Organismos y Programas para introducirla en todos los niveles educativos. Respecto a las directrices más importantes, es necesario definir una política clara que reconozca la importancia de las nuevas tecnologías, elabore currícula y dote de los medios necesarios, que desarrolle un plan de perfeccionamiento de profesorado y fomente programas de investigación.

Avaliação das quimiocinas e da expressão de seus receptores em células mononucleares de pacientes portadores da doença de Chagas submetidas à infecção in vitro com Trypanosoma cruzi e tratamento com benzonidazol

Atualmente o Brasil apresenta 3 milhões de indivíduos portadores da cardiomiopatia chagásica. Porém, tratamento etiológico com o fármaco Benzonidazol (BZ) na fase crônica da doença ainda não está elucidado. Acredita-se que a recomendação do BZ nessa fase, pode prevenir ou retardar a evolução clínica da cardiomiopatia na Doença Chagas (DC). Assim o objetivo do estudo é avaliar a produção de quimiocinas e expressão de seus receptores em Células mononucleares do sangue periférico - PBMC (de portadores crônicos da doença de Chagas) submetidas in vitro ao tratamento com BZ, após a infecção com T.cruzi. Foram selecionados 11 pacientes na fase crônica da doença. Amostras de sangue desses pacientes foram coletadas para obtenção de PBMC, em que foram cultivadas em placas de cultivo na concentração de 106 células/ml por poço. Após a adesão das células aderentes (principalmente macrófagos), as células não aderentes (principalmente linfócitos) foram removidas e as formas tripomastigotas foram adicionadas ao cultivo para infecção das células aderentes. Subsequente a incubação, as células não aderentes foram adicionadas novamente ao cultivo juntamente com o fármaco Bz (1µg/mL), ficando um co-cultivo de células aderentes infectadas com T.cruzi, células não aderentes e o BZ (C+T+BZ). As placas de cultura foram incubadas por períodos de 24h e 5 dias. Para uma análise fidedigna da ação do BZ nas células aderentes e não aderentes foi necessário a criação dos controles: células (C), células e tripomastigotas (C+T) e células e o BZ (C+BZ). Após o cultivo, foram coletados os sobrenadantes das culturas, para avaliação da produção de quimiocinas (CCL2, CXL9, CXL10, CCL5 e CXCL8) por CBA (Cytometric Bead Array). Posteriormente foi realizada a imunofenotipagem, avaliando a expressão dos receptores CCR3, CCR4, CXCR3, CXCR5, CCR1, CXCR4, CXCR2 e CCR5, em linfócitos T CD3+ e monócitos CD14+. Os resultados obtidos na avaliação dos linfócitos mostraram que o receptor CXCR5 esteve aumentado na condição C+T+BZ; e os receptores CCR4 e CCR1 estavam diminuídos nessa mesma condição. Nos monócitos observamos uma diminuição de CCR4 e um aumento do CCR5 nas mesmas condições. Com relação a dosagem de quimiocinas no sobrenadante, foi evidenciado que CCL2 e CXCL8 apresentaram uma diminuição na condição C+T+BZ. Assim podemos concluir que devido ao caráter inflamatório modulado, que o BZ conduziu, podemos afirmar que o fármaco demonstrou benefícios relevantes na expressão de receptores e na produção de quimiocinas

Avaliação do efeito do benzonidazol sobre linfócitos, de portadores crônicos da doença de Chagas, submetidos experimentalmente à exposição ao Trypanosoma cruzi

O único medicamento disponível para o tratamento da doença de Chagas (DC) no Brasil é o benzonidazol (Bz). O beneficio da medicação aos portadores crônicos da doença ainda demonstra controvérsias, mas seu uso nessa fase pode ter a finalidade de prevenir/retardar a evolução da DC para formas mais graves. Os fenômenos imunológicos que ocorrem após a terapia com o Bz ainda não estão elucidados. Assim, este estudo propôs avaliar o efeito do Bz sobre o perfil imunológico de linfócitos T e a produção de citocinas por células da resposta imune expostas in vitro ao T. cruzi. Amostras de sangue de portadores crônicos da DC foram coletadas para obtenção de células mononucleares de sangue periférico com posterior infecção com tripomastigotas de T. cruzi, seguida de adição do Bz às culturas. Após o tempo de cultivo, os sobrenadantes foram estocados para posterior análise das citocinas IFN-gama, TNF, IL-10, IL-6, IL-4 e IL-2 por CBA e as células foram avaliadas por citometria de fluxo, quanto à expressão das moléculas CD28+ e CTLA-4+ e a produção de citocinas (IL-10 e IFN-gama) em linfócitos T CD4+ e CD8+. Nossos resultados mostraram que o tratamento com o Bz aumentou a expressão da molécula CTLA-4+ em linfócitos T CD8+, indicando que o Bz pode induzir uma modulação da resposta imune e, consequentemente, diminuir a ativação exacerbada dessas células. Além disso, verificamos uma diminuição da produção da citocina IL-10 por linfócitos T CD4+ na presença do Bz. Com relação à produção global de citocinas por células aderentes e não aderentes, observamos que o Bz causou uma diminuição da citocina pró-inflamatória TNF e da citocina anti-inflamatória IL-10, enquanto que as outras citocinas (IFN-gama, IL-6, IL4 e IL-2) permaneceram com níveis elevados de produção na presença desse fármaco. Nossos resultados sugerem que o Bz induz uma regulação da ativação de linfócitos T CD8+ e a produção de citocinas do perfil Th1 modulado por citocinas do perfil Th2, em células de portadores crônicos da DC. Assim, acreditamos que a administração do Bz aos portadores de formas clínicas brandas da DC pode ser benéfica a esses pacientes, visto que o Bz não promoveu um perfil inflamatório exacerbado

Prevalência de soropositivos para Doença de Chagas em uma amostra da população de cães domiciliados da cidade de Porto Alegre

Resumo não disponível.

Soropositividade para doença de Chagas entre doadores de sangue em Araraquara, Estado de São Paulo, no período de 2004 a 2008

INTRODUÇÃO: A transfusão sanguínea é uma fonte potencial importante para transmissão da doença de Chagas. MÉTODOS: Foi verificado, nos arquivos do Hemonúcleo Regional de Araraquara, o resultado dos exames para doença de Chagas entre janeiro de 2004 e dezembro de 2008. RESULTADOS: Foram diagnosticadas com sorologia positiva 0,04% das 49541 doações de sangue realizadas. A idade dos soropositivos situou-se entre 51 e 60 anos. CONCLUSÕES: O baixo índice de doadores soropositivos pode reduzir o risco de transmissão via transfusional da doença de Chagas. A alta ocorrência de resultados inconclusivos indicam que os métodos diagnósticos devem ser melhorados.